Phytomedicine：枸杞纳米囊泡促进MC3T3-E1细胞增殖和骨折愈合

背景：骨折愈合过程往往伴随着严重的并发症，包括延迟愈合和不愈合。在临床治疗过程中，某些情况下需要大量的骨再生（超出正常的自愈潜力），如创伤、感染、肿瘤切除等，以及骨再生过程受损的情况，包括缺血性骨坏死、骨萎缩和骨质疏松症。目前，骨折的主要治疗原则是复位、固定、和功能锻炼。其他药物和注射疗法常作为手术治疗的辅助手段来促进骨折愈合。然而，目前用于治疗骨折或促进有效骨愈合的药物疗法相当有限，因此，需要寻找新的或潜在的策略来有效促进骨愈合。

枸杞是一种传统中草药，广泛应用于保健品和临床治疗，其强筋健骨的功效早已载入医学典籍，而植物外泌体样纳米囊泡（PELNVs）因其生物学特性而受到越来越多的关注。为此，该研究拟探讨枸杞衍生纳米囊泡（GqDNVs）对骨折愈合的作用、调节作用及其机制。

方法与结果：采用蔗糖密度梯度差速离心法从宁夏产新鲜枸杞果实中分离纯化枸杞源性纳米囊泡（GqDNVs），经1000 g（10 min）、3000 g（20 min）、10000 g（40 min）逐级离心去除杂质后，150000 g超速离心获得沉淀，再通过8%/30%/45%/60%蔗糖梯度纯化，收集30%-45%界面组分，0.22 μm滤膜除菌。透射电镜（TEM）显示GqDNVs呈典型杯状结构，纳米颗粒追踪分析（NTA）测定浓度为9.48×10¹⁰ particles/ml，粒径主要分布在100-200 nm。非靶向代谢组学（UPLC-ESI-MS/MS）分析鉴定出GqDNVs富含糖类、有机酸等活性成分。

体外实验采用MC3T3-E1前成骨细胞，CCK-8法证实GqDNVs（4.74×10⁹ particles/ml）可逆转地塞米松（1 μmol/l）诱导的细胞活力抑制（p<0.05），PKH-26荧光标记显示其12 h内被细胞高效内化。ALP染色及活性检测表明GqDNVs显著促进成骨分化（第7天活性提升2.1倍），Western blot显示RUNX2、OPN蛋白表达上调。机制研究发现GqDNVs通过激活PI3K/Akt/mTOR/p70S6K/4EBP1通路发挥作用，LY294002（PI3K抑制剂）和雷帕霉素（mTOR抑制剂）可阻断该效应。与枸杞多糖（LBPs）对比实验显示，GqDNVs（4.74×10⁹ particles/ml）在促进细胞迁移（划痕实验愈合率提高58%）和抑制炎症因子（IL-6、IL-1β分泌降低42%）方面优于LBPs（400 μg/ml）。

体内建立C57BL/6小鼠股骨骨折模型，CM-Dir标记活体成像显示GqDNVs在骨折部位滞留超过48 h。Micro-CT分析表明，局部注射GqDNVs（9.48×10¹⁰ particles/ml，14天）使骨体积分数（BV/TV）增加37%，骨小梁数量（Tb.N）提高29%。组织学（H&E/Masson/番红O染色）显示GqDNVs组软骨痂面积减少52%，硬骨痂占比提升。免疫荧光证实GqDNVs下调IL-6/IL-1β表达（p<0.01），同时促进OPN、BGP等成骨标志物分泌。Western blot进一步验证GqDNVs激活PI3K/Akt/mTOR通路关键蛋白磷酸化。

结论：GqDNV能有效促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化，并能促进骨折愈合，这与PI3K/Akt/mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路有关。研究结果共同表明，GqDNV作为促进骨折愈合的治疗策略具有很大的前景。未来需专注于长期安全性评估和临床转化，并探索GqDNV作为药物递送纳米载体的潜力，发现骨折愈合的其他治疗应用。

原始出处：

Xu S, Zhang Z, Zhou X, et al. Gouqi-derived Nanovesicles (GqDNVs) promoted MC3T3-E1 cells proliferation and improve fracture healing. Phytomedicine. Published online April 11, 2025. doi:10.1016/j.phymed.2025.156755