山大口腔葛少华教授/马保金研究员《AFM》：线粒体靶向的多酚/氨基酸纳米颗粒恢复线粒体稳态实现骨组织缺损的有效修复

骨组织缺损的病因包括感染、肿瘤、创伤、骨质疏松、手术、先天性疾病等。如何实现骨组织缺损的有效修复仍是目前临床难题及研究热点。线粒体是细胞基本功能以及组织修复和再生的能量来源。骨组织损伤中过度产生的活性氧（ROS）可引起骨髓间充质干细胞（BMSCs）氧化应激及线粒体损伤，对其成骨分化和组织修复产生负面影响。山东大学口腔医学院（口腔医院）葛少华教授/马保金研究员构建了一种靶向线粒体的多酚/氨基酸自组装纳米颗粒（EC NPs）。一方面，通过有效清除胞内ROS，特别是线粒体ROS（mtROS），恢复线粒体膜电位（MMP），并通过增加抗氧化酶活性和GSH水平增强固有抗氧化系统，重建氧化还原稳态。另一方面，通过上调AMPK信号通路介导的线粒体生物发生为成骨分化及组织修复提供更多能量，并激活cGMP-PKG信号通路直接促进成骨分化，进而实现骨组织缺损的有效修复。这项工作证明了EC NPs通过恢复BMSCs氧化还原稳态、线粒体稳态及增强能量代谢促进骨缺损修复的重要作用，为组织修复再生提供了一种新的策略。该研究以题为“Mitochondria-Targeted Polyphenol-Cysteine Nanoparticles Regulating AMPK-Mediated Mitochondrial Homeostasis for Enhanced Bone Regeneration”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

【文章要点】

通过扫描电镜（SEM），透射电子显微镜（TEM）及动态光散射（DLS）确认了EC NPs为均一纳米球，其粒径随搅拌时间延长而增大。通过光电子能谱（XPS）确认了表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与半胱氨酸（Cys）通过曼尼西反应及希夫碱进行结合。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）及核磁共振图谱（¹H NMR）分别确认了EC NPs中EGCG分子骨架及亚甲基桥和苯并恶嗪单元的存在。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析结果在自组装过程中有二聚体及三聚体的存在。根据X射线衍射分析结果（XRD），Cys具有典型的衍射峰，但与EGCG结合后表现为无定形结构。紫外-可见光谱（UV-vis）结果表明EC NPs具有自荧光特性并主要表现为蓝色。

图1 EC NPs表征

利用Mito-Tracker Green对BMSCs线粒体染色后，观察EC NPs与线粒体的荧光共定位，结果表明EC NPs与线粒体的空间分布具有重叠性，并与线粒体表面相接触。细胞TEM结果表明EC NPs分布于线粒体周围，并同样与线粒体表面相接触，这有助于克服mtROS的有限的释放半径进而恢复线粒体稳态。

图2 生物相容性及线粒体靶向性

EC NPs通过上调AMPK信号通路促进线粒体生物发生，进而线粒体质量及ATP生成增加，细胞TEM结果表明过量ROS环境对线粒体造成损伤，经EC NPs处理后，新生线粒体出现在损伤线粒体周围，其数量明显增多。此外，EC NPs还可上调cGMP-PKG信号通路直接促进成骨分化。

图3 线粒体生物发生

进一步选用大鼠颌骨缺损模型进行动物实验，Micro-CT、HE染色、Masson染色、免疫组化及免疫荧光结果均表明EC NPs有效促进骨组织再生。PGC-1𝛼和mtTFA免疫荧光结果表明经EC NPs处理后，骨缺损区域生成更多线粒体进而为骨组织修复提供更多ATP。

图4 大鼠颌骨缺损模型

图5 体内实验免疫组化及免疫荧光结果

【结论与展望】

骨组织缺损中过量产生的ROS会造成BMSCs氧化应激及线粒体损伤，进而破坏细胞能量代谢系统，ATP生成减少，导致其成骨分化减弱，组织修复受损。本研究中EC NPs通过实现胞内ROS的有效清除，靶向线粒体清除mtROS，上调AMPK信号通路介导的线粒体生物发生提供更多ATP及激活cGMP-PKG信号通路直接促进成骨分化，最终实现骨组织缺损的有效修复。

骨缺损局部病理改变及EC NPs的保护作用示意图

山东大学口腔医学院（口腔医院）葛少华教授、马保金研究员为该论文的共同通讯作者，硕士研究生于舒凡同学为第一作者。近年来，山东大学口腔医学院（口腔医院）高度重视学科交叉融合，主动对接国家战略需求，大力推进“口腔+X”团队攻关，取得了一系列交叉研究成果。葛少华教授、马保金研究员口腔生物材料交叉研究团队致力于功能材料在口腔医学领域的基础和应用研究，研究成果已在Nat. Rev. Mater.(2023)、Adv. Funct. Mater. (2024/2023)、Adv. Sci. (2024)、ACS Nano (2022)、Composite Part B (2022)、Small (2024/2021)等国际著名期刊发表。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adfm.202402463