Cell子刊：定制化、低成本的高分辨率纳米图案空间转录组学平台Nova-ST

转录组学是对细胞或细胞群中的基因表达进行研究，但常规的转录组学研究方法缺乏对空间信息的捕获能力。幸运的是，空间转录组学已成为一种强大的工具，使科学家们能够捕捉组织或细胞的空间背景。但现有空间转录组学技术往往存在成本高、分辨率有限或兼容性不足等问题。

近日，来自比利时的研究人员在Cell Reports Methods发表了题为“Nova-ST: Nano-patterned ultra-dense platform for spatial transcriptomics”的文章，报道了一种新型空间转录组学技术—Nova-ST。Nova-ST是一种具有成本效益且易于使用的纳米图案空间转录组学平台，可以使用Illumina的高密度图案化流动槽对大型组织切片进行空间测序，进行定制化、低成本、灵敏和高分辨率的空间分析。在小鼠脑组织切片上的基准测试表明，与现有方法相比，Nova-ST的灵敏度显著提高，成本也有所降低。Nova-ST由实验和计算两部分组成，实施和执行Nova-ST实验工作流程所需的指导和资源可在https://www.protocols.io11,12和https://nova-st.aertslab.org/上获得，计算流程可在https://github.com/aertslab/Nova-ST上获得。

文章发表在Cell Reports Methods

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主要研究内容

Nova-ST工作流程的实现

Nova-ST的核心是对通常用于大规模DNA测序的Illumina NovaSeq 6000 S4或新一代Novaseq X的流动槽进行巧妙改造，这些流动槽包含一个密集的纳米图案表面，上面布满了随机条形码的微小纳米孔，以六边形晶格排列。每个孔都作为组织样本中特定位置的mRNA 分子的捕获位点，这种密集的纳米图案表面使Nova-ST能够实现高空间分辨率，并有可能捕获单个细胞的转录组信息。

更加重要的是，利用这些基于纳米捕获位点捕获的mRNA分子，能够同时保留它们的空间坐标。随后，Nova-ST对这些捕获的mRNA分子进行测序，揭示每个捕获位点的基因表达谱，通过整合空间信息，则可以重建整个组织切片的基因活性详细图谱。

Nova-ST平台具有几个关键优势。首先，具有成本效益。通过利用现有的Illumina流动槽和新的芯片切割技术，可以从单个流动槽中创建多个Nova-ST芯片，与现有方法相比大大降低了成本。其次，密集的图案化表面可使Nova-ST能够实现高空间分辨率，并有可能在单细胞水平捕获基因的表达情况。第三个优势在于其高兼容性。Nova-ST与各种组织类型兼容，使其成为研究不同生物系统的多功能工具。此外，Nova-ST还与NovaSeq X系列的流动槽兼容，表明Nova-ST可以受益于测序技术的不断进步而不断更新。

图1. Nova-ST平台工作流程

Nova-ST的性能评估

随后，研究人员对Nova-ST的性能进行评估。通过不同层面的重复，研究发现Nova-ST文库的质量在来自不同流动槽的芯片之间以及相同流动槽的不同芯片间是一致的，表明了该工作流程的鲁棒性和一致性。基于空间数据的质量指标分析结果，不同的Nova-ST芯片之间的性能、一致性和可重复性也都被证实。此外，标记基因的空间表达证明了Nova-ST检测的标记基因的表达都定位在正确的大脑区域，如大脑皮层的Lamp5和海马层的Bcl11a，并且每个基因的空间表达模式在已发表图谱和Nova-ST数据之间高度一致。

对Nova-ST测序数据的无偏颇聚类分析确定了小鼠皮质中的各个层以及海马内的亚型。研究人员使用cell2location将小鼠皮质和海马的独立单细胞转录组测序（scRNA-seq）数据集映射到Nova-ST数据中，结果表明其正确地识别了所有注释的scRNA-seq细胞类型在皮层和海马中的位置，并且细胞类型总体上与无偏颇聚类结果相对应。

图2. 基于小鼠脑切片的Nova-ST性能评估

与现有空间转录组学技术的比较

最后，研究团队比较了Nova-ST与其他基于测序的空间转录组学技术的性能。首先，在控制测序深度的情况下，将Nova-ST与其他方法进行比较发现，Nova-ST文库与Stereo-seq文库在映射百分比和注释读数方面具有相似的指标（Nova-ST 83.51%和73.04% vs. Stereo-seq77.9%和62.55% )。不过，Nova-ST具有优越的复杂性，其允许在较低的测序深度下检测到更多的基因/UMI，并在更深的测序中获得更多的信息。bin大小为200时，Nova-ST检测到的基因中位数为6,318个，Stereo-seq平台检测到的基因中位数为4,092个(图3E和4B)。

研究人员还将Nova-ST的单基因捕获效率与其他方法进行了比较。分析显示，Nova-ST基因计数与其他技术相关性良好，与其它四个数据集（Visium HD 和三个Stereo-seq）的相关性分别为0.83、0.93、0.92和0.95。比较检测到的基因，Visium HD的计数略高，中位数提高了1.57倍。与Stereo-seq相比，Nova-ST在检测效率范围内下降，其检测的中位数比Stereo-seq数据集高1.11-2.05倍。因此，性能取决于测序深度，但这较少的读取情况下，Nova-ST仍然获得更高的计数。

为了评估Nova-ST和其他基于测序的方法捕获的RNA数量，研究人员将选定区域的计数与高灵敏度的osmFISH数据进行了比较。所有基于测序的方法只捕获了组织样本中存在的总RNA的百分之几。在不对各空间数据集的测序深度进行归一化的情况下，Nova-ST的中位基因检测效率为1.08%，Visium HD为1.3%，三个Stereo-seq数据集分别为0.43%、0.79%和2.48%。

图3. Nova-ST与其他空间转录组学技术的比较

结 语

综上所述，该研究报道了一种超密度的纳米图案空间转录组学技术Nova-ST。Nova-ST能够实现定制化、低成本、高灵活性、高灵敏度和高分辨率的组织切片空间分析。Nova-ST的成本（包括第一链合成和文库准备的试剂）约为7.5欧元/mm2 ，不包括测序成本，这为大规模空间转录组学的经济高效分析铺平道路。此外，由于Nova-ST的开源灵活性，研究人员可以进一步开发整合其他多组学模式，如使用ATAC-seq进行染色质可及性测定等，从而使Nova-ST得到更广泛的使用。

Nova-ST是物种不可知的，也可用于研究非模式生物。据悉，研究团队已经在应用Nova-ST来推进在神经退行性疾病和癌症生物学方面的研究，并与其他课题组合作来扩展Nova-ST平台，使其能够同时对免疫细胞受体和基因表达进行空间分析，这些合作也突出了Nova-ST的实际应用及其影响各个领域的潜力。

文章通讯作者、比利时鲁汶天主教大学生物工程学家和计算生物学家Stein Aerts博士表示：“Nova-ST是从癌症生物学到植物生物学等多个领域研究的变革技术，通过推出这个开源平台，我们旨在助力全世界的科学家探索和创新的能力。”

论文原文：

Poovathingal et al., Nova-ST: Nano-patterned ultra-dense platform for spatial transcriptomics, Cell Reports Methods (2024). https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S2667-2375%2824%2900204-2