晚期乳腺癌基于ctDNA检测的基因变异阳性率高，影响35%患者的治疗决策

循环游离肿瘤DNA（ctDNA）为评估体细胞变异提供了一种非侵入性的方法。德国的PRAEGNANT注册研究旨在探索分子生物标志物，并研究将其整合到临床实践中的情况。在此背景下，纳入了ctDNA检测，以了解临床医生启动检测的动机，识别体细胞变异，并评估所获得检测结果的临床影响。患有晚期/转移性乳腺癌的患者被前瞻性纳入了 PRAEGNANT研究（临床试验注册号NCT02338167）。使用了经美国FDA批准且带有CE认证标志的GUARDANT360 CDx检测方法来评估体细胞变异。一份ctDNA分析报告连同一份有关检测意图以及检测结果临床意义的调查问卷一同提供给了主治医生。

前瞻性地分析了49名患者的ctDNA：其中37名（76%）在分析的基因集中至少存在一种体细胞变异；14名患者（29%）携带TP53基因变异，12名（24%）携带PIK3CA基因变异，6名（12%）携带ESR1基因变异。分别在3名（6%）和4名（8%）患者中检测到了BRCA1或BRCA2基因的体细胞突变，并且59%的患者患有HR阳性、HER2阴性的乳腺癌。针对48名（98%）患者完成了有关检测意图和临床影响的调查问卷。结果显示，ctDNA检测影响了35%患者的治疗决策。

通过ctDNA基因分型确定的TP53、PIK3CA、ESR1和BRCA1/2基因中体细胞变异的高发生率，突显了它们作为靶向治疗生物标志物的潜力。特定突变的检测影响了治疗决策，例如确定患者是否适合使用阿培利司（alpelisib），并且在未来的治疗方案中，可能会进一步推动艾拉司群（elacestrant）或卡帕塞替尼（capiversatib）等药物的治疗应用。

研究背景

乳腺癌的基因组谱：

基因变异是确定乳腺癌及其他实体瘤患者最佳治疗方案的一个关键特征。胚系DNA变异与治疗结果之间的关联已有详尽的阐述，例如，胚系BRCA1或BRCA2突变的分析已被确立为PARPi奥拉帕利的伴随诊断方法。然而，在过去几年里，体细胞变异对于精准医疗也变得愈发重要。具体而言，对于HR+乳腺癌亚型的患者，基于肿瘤突变谱的治疗格局已发生了显著变化。众所周知，HR+肿瘤从原发性肿瘤群体发展到发生转移的过程中会经历显著的基因组图谱变化，并且体细胞变异通常在内分泌治疗期间出现，并导致治疗耐药。常见的变异包括ESR1区域的突变、MAP激酶通路的突变，以及各种转录因子的变异，比如ARID1A。最近，将体细胞变异作为伴随诊断的获批情况突显了检测的重要性。美国FDA的批准包括：阿培利司用于患有HR+、HER2-的晚期或转移性、PIK3CA突变型乳腺癌的绝经后女性和男性；艾拉司群用于患有ER+、HER2-、晚期或转移性、ESR1突变型乳腺癌的绝经后女性或成年男性；以及卡帕塞替尼用于患有HR+、HER2-、局部晚期或转移性乳腺癌且携带一种或多种PIK3CA、AKT1或PTEN变异的患者。在这方面，诸如用于PIK3CA突变分析的therascreen PIK3CA RGQ PCR检测试剂盒，以及用于血浆样本中ESR1检测的Guardant360 CDx检测等伴随诊断检测方法也已获得了FDA的批准。

体细胞DNA变异可以通过分析通过侵入性活检或手术获取的肿瘤组织本身（例如FFPE）来评估，也可以通过分析从癌症患者外周血中采集的血浆中的ctDNA来评估。与通过活检或手术获取的样本不同，ctDNA分析的侵入性极小，并且能够进行持续监测，评估空间和时间异质性，甚至可以反映极小的肿瘤负荷。在“哌柏西利与用于检测ESR1突变的循环肿瘤DNA”（PADA-1）试验中，已证明了分析和监测ctDNA的重要性。PADA-1研究纳入了1017名患有晚期HR+且HER2-乳腺癌的女性，该研究表明，与标准治疗相比，在检测到突变后改用氟维司群使无进展生存期（PFS）延长了一倍。此外，一些正在进行和已完成的试验正在探索利用体细胞变异来指导治疗决策。聚焦于晚期乳腺癌中ctDNA分析的血浆MATCH试验，以及德国的利用全基因组/外显子组和转录组测序的COGNITION-Guide试验和CATCH试验，其目标都是根据个体的基因图谱来定制治疗方案。SOLAR-1试验、INAVO120试验以及EMERALD和PADA试验都是ctDNA检测在患者选择和治疗方案选择方面具有潜力的杰出范例。目前，进一步的III期研究正在进行中，重点例如选择性雌激素受体降解剂及其与CDK4/6抑制剂或其他内分泌治疗药物的联合使用。

德国ctDNA检测的可行性：

鉴于不断演变的治疗格局，以艾拉司群、阿培利司和卡帕塞替尼的推出以及即将上市的伊那利塞（inavolisib）为特点，分子伴随诊断将成为治疗决策中不可或缺的一部分。然而，在德国及其他欧盟国家，突变检测，尤其是ctDNA检测的现状仍未完全确立。随着欧洲委员会于2023年9月批准了艾拉司群，首次出现了一种需要进行ctDNA检测的乳腺癌患者治疗方案，这已成为常规治疗的一部分。在此背景下，欧洲肿瘤内科学会（ESMO）精准医学工作组推荐对ctDNA进行ESR1突变检测。此外，虽然可以选择仅检测ESR1基因区域，但也有多种检测方法[靶向或下一代测序（NGS）]，能够按照ESMO 2024年的NGS建议，对更广泛的基因panel进行分析。然而，这种基因panel检测也能够检测到未获批治疗方案的相关基因变异，或者其他癌症类型的治疗相关基因变异。在这种情况下，此类基因检测结果的后果以及对患者的临床影响仍有待评估。在德国的注册研究PRAEGNANT中，对某些生物标志物的检测被证明是一种很有前景的方法，不仅能够为患者提供基于研究的检测结果，还能帮助患者入组临床试验。在这一背景下，本项目旨在为参与PRAEGNANT注册研究的患者提供经过验证的ctDNA基因panel检测，并评估主治医生的检测意向以及检测结果的临床影响。

研究结果

检测启动：

医生总共为52名患者启动了53次检测，并将样本运送至PRAEGNANT中央生物样本库。从采血到样本抵达GUARDANT Health中央实验室的中位运输时间为4天（范围：1至18天）。GUARDANT Streck采血管中的样本稳定性已被验证可长达7天，以确保安全运送至实验室。通常情况下，来自欧洲的样本会在24至72小时内抵达实验室。在这53个样本中，有3个样本因运送至GUARDANT Health中央实验室的时间过长（>7天，n = 2）或因为来自复诊患者（n = 1）而不符合检测条件。有1名患者因入组失败而被排除在最终分析之外（图1）。在采血后7天内被GUARDANT Health中央实验室接收的所有样本（n = 49，100%）都成功进行了测序。因此，对49名患者的ctDNA进行了检测并纳入分析。纳入研究的患者在初次诊断时的平均年龄为48.4岁，在进行ctDNA检测时的平均年龄为55.5岁（表1）。纳入的大多数患者为HR+且HER2-（n = 29，59%，表1）。总体而言，在整个研究组中，18名患者（51%）在检测启动时处于一线治疗阶段，其中12名（48%）属于HR+/HER2-队列（表1）；6名（17%）患者患有HER2扩增型肿瘤，5名（14%）患者患有三阴性肿瘤。

图1

表1

基因变异的频率：

总共有39名（80%）患者在被分析的基因中至少有一个基因发生了变异，33名（67%）患者存在一个以上基因变异。在这些变异中，有9个检测到的变异等位基因频率（VAF）大于40%，因此被标记为可能的胚系突变，并被排除在随后的体细胞突变分析之外。基于这一阈值，37名（76%）患者至少存在一个体细胞变异，32名（65%）患者存在一个以上基因的体细胞变异（图2）。根据VAF≥0.4%的阈值，检测到31名（63%）患者的ctDNA呈阳性。最常受影响的基因是TP53（n = 14，占29%）、PIK3CA（n = 12，占24%）、FGFR1（n = 10，占20%）和ATM（n = 8，占16%）（图2）。分别在3名（6%）和4名（8%）患者中检测到BRCA1或BRCA2的体细胞突变。其中一个BRCA2突变被归类为同义突变，一个BRCA2和三个BRCA1的变异被判定为意义未明的变异。在6名（12%）患者中检测到ESR1基因变异（图2）。

图2

在HR+/HER2-患者亚组中，8名（28%）患者的TP53基因发生了变异，8名（28%）患者的PIK3CA基因发生了变异，6名（21%）患者的FGFR1基因发生了变异，6名（21%）患者的ATM基因发生了变异（图2）。分别在3名（10%）和1名（3%）患者中检测到BRCA1和BRCA2基因变异。在整个队列中，所有6名ESR1基因发生变异的患者均患有HR+且HER2-的乳腺癌，占HR+/HER2-亚组的21%（图2）。

根据每个基因的平均VAF，对体细胞变异（VAF<40%）进行了进一步分析。发现MAP2K2变异具有最高的平均VAF（平均为22.70%，n = 1），其次是ARID1A基因（平均为14.18%，范围为1.85%-26.50%）和BRCA2基因（平均为8.76%，范围为0.20%-33.80%，图3A）。BRCA1基因变异的平均VAF为0.23%（范围为0.10%-0.30%），ESR1基因变异的平均VAF为1.75%（范围为0.05%-12.81%，图3A）。总体而言，11名（22%）患者在最常受影响的四个基因（TP53、PIK3CA、FGFR1和ATM）中，有一个以上的基因发生了变异（缺失、突变或扩增；图3B）。PIK3CA基因中最常见的体细胞突变是E545K、E726K、E542K和H1047R（各n = 2），ESR1基因中最常见的体细胞突变是D538G（n = 4；图3C）。

图3

检测到的可靶向突变：

GUARDANT360 CDx检测报告基于检测到的基因变异，提供了（EMA批准的疗法）治疗建议。这些治疗建议可能是针对所关注的癌症（此处为乳腺癌）获批的疗法，也可能是针对其他适应症的疗法。此外，与对某些治疗方案无应答相关的基因变异（表明存在耐药机制）也会被报告。在8名（16%）患者中检测到了针对乳腺癌已获批的可靶向治疗的体细胞突变，在13名（27%）患者中检测到了针对其他适应症的可靶向治疗的体细胞突变，在7名（14%）患者中检测到了与治疗无应答相关的基因变异（表2）。这些基因变异的分子结果包括错义突变、无义突变、移码突变、框内插入/缺失或剪接变异，因此会影响蛋白质结构（表2）。基于以下基因变异确定了针对其他适应症获批的治疗方案：ATM、ERBB2、PIK3CA、BRCA2、RET、NF1、EGFR和MET。这些基因变异指导了各种超说明书用药或临床试验治疗的建议，包括奥拉帕利、德曲妥珠单抗、阿培利司、卢卡帕利、他拉唑帕利、普拉替尼、塞尔帕替尼、司美替尼、阿法替尼、达可替尼、厄洛替尼、吉非替尼、奥希替尼和特泊替尼（表2）。报告显示，在ESR1、FGFR2和RET基因位点检测到的基因变异与治疗无应答相关。基于ESR1突变的无应答情况表明，对阿那曲唑、依西美坦和来曲唑治疗无应答（表2）。

表2

检测意向与临床影响：

治疗医师对48例患者（98%）完成了关于检测意向和临床影响的问卷。根据给出的答案，在检测开始时，对于检出BRCA1或2突变的患者，29%（n = 14）有PARPi治疗指征，对于检出PI3KCA突变的患者，19%（n = 9）有阿培利司治疗指征（表3）。对于检出BRCA1/2或PI3KCA变异的患者，56%（n = 27）和54%（n = 26）在下一次更改治疗方案时有PARPi或阿培利司治疗的适应证（表3）。3例患者（6%）没有PARPi或阿培利司治疗的适应证。对于其中2例患者，治疗医师回复称，从下一次更改治疗方案开始，存在另一种基因变异的适应证（表3）。

表3

总体而言，ctDNA检测影响了35%（n = 17）患者当前或未来的治疗决策（表 4）。其中，12%（n = 2）的患者做出了采用 PARPi治疗的决策，41%（n = 7）的患者做出了采用 PI3K 抑制剂治疗的决策，74%的患者做出了其他治疗决策，由于可选择多种治疗方案，各项占比总和超过了100%（表4）。主治医生反馈称，在成功接受检测的患者中，有 59%（n = 27）的患者从 GUARDANT360 CDx 检测中获益。尽管随检测结果一同发出的信件中因数据已匿名化而建议对检测结果进行验证，但对于大多数患者（n = 34，74%），并未在肿瘤组织上对 GUARDANT360 CDx检测结果进行验证（表 4）。至少在问卷填写完成时，情况仍是如此。在对FFPE组织进行验证的患者中，大多数反馈者表示，在FFPE肿瘤样本中未检测到 GUARDANT360 CDx 检测所发现的突变（n = 7，70%）（表4）。

表4

 讨 论 

综上所述，PRAEGNANT 360°子项目显示，ctDNA 检测率为76%，基于 VAF ≥ 0.4% 标准的 ctDNA 阳性率为 63%，最常见的基因变异发生在 TP53、PIK3CA、FGFR1 和 ATM 基因。这一发生率与类似试验的结果相符。在一个 HR+/HER2- 转移性乳腺癌患者的真实世界队列中，65% 的病例检测到了 ctDNA。近期一项研究评估了 ER+/HER- 转移性患者队列中的 ctDNA 变异情况。其中，96% 的患者可检测到 ctDNA，69% 的患者根据 VAF ≥ 0.4% 的标准被判定为 ctDNA 阳性疾病。ctDNA 检测率会因所采用的测序方法和设定的靶标数量而有所不同。一项针对 233 例转移性乳腺癌患者的 ctDNA 进行分析的研究，采用靶向捕获深度测序技术，聚焦于 1021 个常见突变基因，结果发现 85% 的病例存在 ctDNA 变异（VAF ≥ 1%）。与本研究结果一致的是，TP53 变异最为常见，在 36% 的病例中出现。此外，PIK3CA 突变（26%）和 BRCA1/2 突变（10%）的发生率与本研究结果非常接近（PRAEGNANT 全队列中分别为 24% 和 14%）。然而，ESR1 变异的发生率（6%）明显低于本研究的 PRAEGNANT 全队列（12%）。PRAEGNANT 队列完全是根据医生的判断选择的患者，而 Liu 等人检测的患者为三阴性或 HR+/HER2+ 转移性乳腺癌患者，因此未接受过内分泌治疗。已知内分泌治疗会促使 ESR1 突变肿瘤细胞的克隆性扩增，从而导致内分泌耐药。PRAEGNANT 队列中超过 59% 的患者为 HR+/HER2- 乳腺癌患者，可能都接受过某种形式的内分泌治疗；该亚组中有 21% 的患者可检测到具有临床意义的 ESR1 突变。一项对多项评估激素敏感性乳腺癌中 ESR1 突变的试验进行的汇总分析显示，总体发生率为 23%（95%CI 18% - 28%），与本研究结果一致。发生率的差异主要归因于不同的研究人群、预处理情况和其他选择标准。纳入曾接受过芳香化酶抑制剂治疗患者的临床试验显示，ESR1 突变频率在 26% 至 44% 之间。在本研究环境中，针对 ESR1 突变癌症病例的艾拉司群或其他治疗方案在德国尚未获批。因此，选择进行 GUARDANT360 CDx检测的患者并非基于 ESR1 检测选项入选，这可能导致与当前其他聚焦于内分泌耐药的试验相比，研究的亚人群队列略有不同。

在常规癌症治疗中，ctDNA基因检测对于治疗决策将变得愈发重要。多项研究结果表明，ctDNA分析对制定靶向治疗方案具有重要影响。目前的治疗方案包括：针对ESR1突变肿瘤使用艾拉司群，针对PIK3CA突变使用阿培利司，针对胚系BRCA1/2变异使用PARPi。其他值得关注的基因位点也在研究之中。例如，卡帕塞替尼在携带PIK3CA、PTEN或AKT突变的转移性乳腺癌患者中展现出了具有临床意义的疗效。一项纳入1462例HER2阴性转移性乳腺癌患者的大型研究显示，与基因组变异相匹配的靶向疗法能够延长PFS。除了在晚期或转移性乳腺癌病例中进行基因检测外，ctDNA检测作为监测早期乳腺癌的工具也颇具前景。新辅助治疗期间ctDNA持续存在与治疗反应不佳相关，而通过ctDNA追踪突变能够识别出复发风险高的患者。此外，ctDNA清除与生存结局改善相关。这突显了ctDNA检测在常规临床实践中的潜在价值，不仅适用于晚期乳腺癌的治疗，对早期乳腺癌的治疗方案制定同样适用。

在德国和许多其他国家，像ESR1这类基因的突变检测可能主要由负责的病理学家采用单基因检测方法（如基于PCR的方法）来进行。这种做法是出于经济考量以及保险报销要求。尽管与基因panel测序或全基因组测序相比，检测单个感兴趣的基因区域可能是最具成本效益的，但必须考虑到，患者可能会从检测那些尚未获批作为伴随诊断的基因变异中获益。ESMO关于液体活检应用的建议包括检测ESR1、PIK3CA、BRCA1/2、高度微卫星不稳定（MSI - H）、ERBB2扩增以及NTRK1/2/3融合。建议对ctDNA进行ESR1突变检测，而ERBB2扩增和NTRK融合仅在无法进行晚期组织活检时才进行检测。在PRAEGNANT队列中，研究者发现27%的分析病例存在虽未获批用于乳腺癌治疗，但获批用于其他适应症的体细胞变异。这些受影响的基因包括ATM、ERBB2、PIK3CA、BRCA2、RET、NF1、EGFR和MET。在德国，“CATCH”试验——一项通过进行全基因组和RNA测序来指导治疗决策的前瞻性精准肿瘤学项目——目前正在评估全基因组测序对治疗结局的影响。在首批入组的200名患者中，有53名可进行评估，其中40%的患者病情得到稳定控制，30%的患者PFS得到改善。然而，对肿瘤组织或ctDNA进行测序是否真能带来生存获益仍在讨论之中。近期一项回顾性观察研究评估了NGS检测在癌症患者中的实用性和真实世界结局。结果显示，对于癌症进展迅速、预期寿命短或无标准治疗方案的患者，测序并未带来PFS获益。同样，聚焦于三阴性乳腺癌且新辅助化疗后有残留病灶患者的“BRE12 - 158”II期试验表明，基因组靶向治疗并不优于新辅助化疗后医生选择的治疗方案。该试验对无病生存期和总生存期均进行了评估。不过，患者入组时间是在2014年至2018年之间。从那以后，靶向治疗方案的数量有所增加，因此当前患者可能会有不同的结局。靶向基因panel测序可能是一个不错的选择，它能对体细胞变异进行更广泛的分析，同时避免在无明确获益的全基因组测序上花费过多资金。

在PRAEGNANT 360°子项目中，依据基因panel检测结果，有2例（4%）患者的医生做出了采用PARPi治疗的决策，7例（14%）患者的医生做出了采用PI3K抑制剂治疗的决策，另外还有9例患者（18%）接受了其他未明确说明的治疗。该子项目让研究者了解到ctDNA基因panel检测在真实世界中的潜力。它突显了此类检测结果对临床指导和治疗决策的影响。值得注意的是，在10例使用FFPE肿瘤组织对ctDNA检测结果进行验证的病例中，有7例（70%）在FFPE肿瘤样本中未检测到与ctDNA相同的基因变异。FFPE样本和ctDNA检测结果的一致性在不同癌症类型中存在差异。不过，有报道称乳腺癌的ctDNA和FFPE样本检测结果具有较高的一致性。一项聚焦于FFPE样本DNA和ctDNA中ESR1突变的研究显示，两者的一致率达到91%。在本研究中，仅有26%的ctDNA检测结果在肿瘤组织上进行了验证。因此，70%的不一致率仅占总基因变异的一小部分。此外，关于FFPE肿瘤样本采集和血液采集的时间信息并不明确。在此期间可能发生了治疗方案的改变，从而导致出现新的基因变异，如ESR1突变。另外，决定对某些检测结果进行验证的过程可能会受到一些因素的影响，例如VAF较低、出现意外的基因变异或其他未明确说明的因素。对于未来的研究而言，进一步评估验证失败时所带来的临床后果将是很有意义的。

本研究存在一个局限性，即缺乏对ctDNA中检测到的体细胞变异与肿瘤活检样本中检测到的体细胞变异进行直接比较。FFPE样本和ctDNA检测结果的不一致性是基于医生对问卷的回复得出的。因此，关于手术类型、手术部位或样本采集时间等方面的数据均不可获取。该项目仅基于ctDNA分析进行设计，原因在于并非所有患者在检测时都有肿瘤活检样本可用，而且基于血液的分析侵入性更小，更为便捷。然而，正如“血浆MATCH”试验（一项多中心、多队列的2a期平台试验）先前的分析所示，ctDNA数字PCR与靶向测序（GUARDANT检测）的一致性高达96% - 99%，总体灵敏度为93%，与同期活检样本对比时灵敏度为98%，因此不再需要对ctDNA检测结果进行验证。靶向测序的灵敏度高达90.9%，并且相关检测目前已获得美国FDA和CE的批准，可作为伴随诊断方法，这突显了它们在临床决策中的重要性。其他先前的研究也显示，同期组织的NGS分析结果与Guardant360 Cdx检测结果具有较高的一致率，这也是获得FDA批准的必要条件。

在“PRAEGNANT”研究的这个子项目中，主治医生报告的FFPE样本和ctDNA检测结果之间的差异可能归因于以下几个因素：肿瘤异质性、样本采集时间、验证过程中的选择偏倚以及技术灵敏度差异。肿瘤异质性和样本采集时间或许可以解释ctDNA和FFPE检测结果之间的差异。FFPE组织仅反映单个肿瘤区域的情况，而ctDNA检测能够捕获来自多个肿瘤部位释放的DNA，有可能提供更全面的突变图谱。此外，ctDNA能够提供肿瘤基因的“实时”情况，而FFPE样本通常代表的是较早的状态，会遗漏随时间出现的突变。通常，手术切除的原发性肿瘤会被用于检测，这对于转移性癌症病例来说并非理想选择。在选择特定的ctDNA突变进行FFPE验证时存在的选择偏倚，以及两种检测方法技术灵敏度的差异，可能会进一步导致检测结果不一致。因为ctDNA检测能够检测到FFPE检测可能遗漏的低频突变。

本研究通过ctDNA检测确定了关键的基因突变，这些突变可作为靶向治疗的标志物。研究强调了此类检测结果的临床影响，并突显了在常规诊疗中实施ctDNA检测策略的重要性。鉴于艾拉司群近期获批用于治疗ESR1突变肿瘤以及相关的ctDNA伴随诊断，还有未来其他靶向治疗方案，在德国的临床医疗中应大力考虑实施ctDNA分析的基因panel检测。此外，研究结果支持将在常规基因panel检测中发现有基因突变的患者，作为潜在候选对象纳入以ctDNA突变为治疗入组标准的临床试验。

参考文献：

Hanna Huebner, Pauline Wimberger, Elena Laakmann, Eugen Ruckhäberle, Matthias Ruebner, Sarah Lehle, Sabrina Uhrig, Philipp Ziegler, Theresa Link, Carolin C Hack, Erik Belleville, Iris Faull, Marcus Hausch, Diethelm Wallwiener, Andreas Schneeweiss, Hans Tesch, Sara Y Brucker, Matthias W Beckmann, Peter A Fasching, Volkmar Müller, Tanja N Fehm, Cell-free tumor DNA analysis in advanced or metastatic breast cancer patients: mutation frequencies, testing intention, and clinical impact, Precision Clinical Medicine, Volume 8, Issue 1, March 2025, pbae034, https://doi.org/10.1093/pcmedi/pbae034