临床研究｜慢性HBV感染自然史不同阶段的HBV RNA水平特征及其与HBV DNA、HBsAg的相关性分析

《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》（以下简称“2022年版指南”）将慢性HBV感染自然史仍分为4期，但分期名称及具体标准较2019年版以及美国、欧洲、亚太肝病学会的相关指南有所调整，具体分为：HBeAg阳性慢性HBV感染（免疫耐受期）、HBeAg阳性慢性乙型肝炎（CHB）（免疫清除期）、HBeAg阴性慢性HBV感染（免疫控制期）及HBeAg阴性CHB（再活动期）。在HBV感染者中，存在ALT和HBV DNA水平不符合以上4期分类标准的慢性HBV感染灰区（GZ），也被称为不确定期。血清HBV RNA作为共价闭合环状DNA（cccDNA）的直接转录产物，其本质为核衣壳内逆转录的前基因组RNA（pgRNA），可作为反映肝内cccDNA数量、遗传组成及其转录活性的新型HBV标志物，在判断慢性HBV感染自然史方面具有重要临床价值。然而，目前尚缺乏基于2022年版指南标准，针对慢性HBV感染自然史不同阶段HBV RNA水平分布状况的研究。本研究依据2022年版指南，对306例未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者在不同自然史阶段的HBV RNA水平进行分析，明确其特点及其与血清HBV DNA、HBsAg的相关性。 

1资料与方法

1.1   研究对象

本研究为横断面研究，选取2023年1月—2024年6月于本院感染性疾病/肝病科就诊的慢性HBV感染者，根据2022年版指南诊断标准，纳入以下分期患者：HBeAg阳性慢性HBV感染者、HBeAg阳性CHB患者、HBeAg阴性慢性HBV感染者、HBeAg阴性CHB患者，以及HBeAg阳性慢性HBV感染不确定期和HBeAg阴性慢性HBV感染不确定期的患者。HBeAg阳性慢性HBV感染不确定期定义为：HBV DNA≤2×10⁷ IU/mL且ALT水平正常的HBeAg阳性感染者；HBeAg阴性慢性HBV感染不确定期定义为：HBV DNA为阳性且ALT水平正常的HBeAg阴性感染者。 

1.2   纳入和排除标准

纳入标准：HBsAg阳性≥6个月、未接受抗病毒治疗且年龄在18～70岁的慢性HBV感染者。排除标准：合并HAV、HCV、HEV或HIV感染者；合并遗传代谢性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病、酒精性肝病等其他肝脏疾病患者；合并HBV相关肝癌及其他器官肿瘤患者。 

1.3   研究方法

1.3.1   资料收集

收集所有患者的年龄、性别等一般资料，以及HBV血清学标志物、高敏HBV DNA定量、高敏HBV RNA、肝生化学、血常规、影像学等检查指标数据。 

1.3.2   肝功能和HBV病毒学指标检测

采用常规生化分析仪检测肝功能，ALT正常值上限设定为40 U/L。采用RNA实时荧光恒温扩增检测技术（上海仁度生物科技有限公司，中国），对血清高敏HBV RNA进行定量检测，定量值下限（LLQ）为<100 copies/mL。采用罗氏公司（瑞士巴塞尔）COBAS TaqMan系统实时聚合酶链反应技术（Roche，瑞士）对高敏HBV DNA进行定量检测，LLQ为<20 IU/mL。采用i2000化学发光免疫分析仪（Abbott，美国）和Abbott试剂对HBsAg和HBeAg等HBV血清学标志物进行定量检测。 

2结果

2.1   一般资料和血清HBV RNA水平的比较

共纳入HBV感染者306例，其中HBeAg阳性慢性HBV感染者29例，HBeAg阳性CHB患者107例，HBeAg阴性慢性HBV感染者18例，HBeAg阴性CHB患者60例；此外，HBeAg阳性和阴性慢性HBV感染的不确定期患者分别为7例和85例。 

HBV RNA中位值在HBeAg阳性慢性HBV感染者中最高，在HBeAg阴性慢性HBV感染者中最低。Kruskal-Wallis H检验结果显示，6组间血清HBV RNA水平差异有统计学意义（H=830.770，P<0.001）（表1）。进一步分析表明，HBeAg阳性的慢性HBV感染组与CHB组HBV RNA水平无统计学差异（P=0.107），但与HBeAg阴性慢性HBV感染和CHB组之间的差异均有统计学意义（P值均<0.001）。此外，HBeAg阳性的慢性HBV感染者与不确定期感染者HBV RNA水平差异有统计学意义（Z=-3.711，P<0.001），HBeAg阴性的慢性HBV感染者与不确定期感染者HBV RNA水平差异亦有统计学意义（Z=-2.436，P=0.014）（图1）。

注： IT（e⁺），HBeAg阳性慢性HBV感染；IA（e⁺），HBeAg阳性CHB；IC（e^-），HBeAg阴性慢性HBV感染；IA（e^-），HBeAg阴性CHB；GZ-A，HBeAg阳性慢性HBV感染不确定期；GZ-B，HBeAg阴性慢性HBV感染不确定期。

图1  不同阶段患者血清HBV RNA水平比较

2.2   血清HBV RNA与HBV DNA、HBsAg相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，所有HBV感染者中，HBV RNA水平与HBV DNA水平强相关（r=0.92，P<0.001），与HBsAg中度相关（r=0.67，P<0.001）（图2a、b）。亚组分析显示，HBeAg阳性者中，HBV RNA水平与HBV DNA水平（r=0.68，P<0.001）及HBsAg水平（r=0.61，P<0.001）中度相关（图2c、d）；HBeAg阴性者中，HBV RNA水平与HBV DNA水平强相关（r=0.84，P<0.001），与HBsAg弱相关（r=0.31，P<0.001）（图2e、f）。

注： a、b，所有慢性HBV感染者；c、d，HBeAg阳性者；e、f，HBeAg阴性者。

图2  纳入患者血清HBV RNA与HBV DNA、HBsAg的相关性分析

2.3   不同ALT水平的HBeAg阳性慢性HBV感染者血清HBV RNA水平分层比较

在HBeAg阳性慢性HBV感染者（ALT水平正常，即<40 U/L）中，将ALT≤30 U/L的男性和ALT≤19 U/L的女性患者分为A组（n=16），ALT>30 U/L的男性及ALT>19 U/L的女性患者分为B组（n=13）。A、B组及HBeAg阳性CHB患者的血清HBV RNA水平分别为7.8（7.6～8.0）、7.6（7.4～8.0）和7.4（6.4～7.9）log₁₀ copies/mL，3组间差异有统计学意义（P<0.001）。两两比较结果显示，A组HBV RNA水平明显高于B组（P<0.001）及HBeAg阳性CHB组（P=0.001），B组与HBeAg阳性CHB组比较无统计学差异（P>0.05）（图3）。

图3  不同ALT水平的HBeAg阳性慢性HBV感染者及HBeAg阳性CHB患者血清HBV RNA水平比较

3讨论

慢性HBV感染自然史的划分主要依据病毒学、生物化学及组织学特征进行综合评估。美国肝病学会（AASLD）指南中4个时期对应的HBV DNA水平分别为>10⁶ IU/mL、>2×10⁴ IU/mL、<2×10³ IU/mL和>2×10³ IU/mL，而2022年版指南中4个时期对应的HBV DNA水平分别为>2×10⁷ IU/mL、阳性、阴性和阳性。目前，关于慢性HBV感染不同自然史分期HBV RNA状况的研究多参照美国肝病学会指南的分期标准，尚未有基于我国指南标准对慢性HBV感染自然史分期HBV RNA状况的分析。 

一项针对1 409例未经治疗的北美慢性HBV感染者的研究，根据HBeAg状态、HBV DNA和ALT水平进行自然史分期，并检测各分期的HBV RNA水平。该研究将HBV DNA≥10⁵ IU/mL且ALT水平正常的HBeAg阳性感染者纳入HBeAg阳性慢性HBV感染，将HBV DNA≥10⁵ IU/mL且ALT水平升高的HBeAg阳性感染者纳入HBeAg阳性CHB，将HBV DNA≤10⁴ IU/mL且ALT水平正常的HBeAg阴性感染者纳入HBeAg阴性慢性HBV感染；而将HBV DNA>10⁴ IU/mL且ALT水平升高的HBeAg阴性感染者纳入HBeAg阴性CHB。此外，将HBV DNA<10⁵ IU/mL的HBeAg阳性HBV感染者定义为HBeAg阳性不确定期［indeterminant HBeAg positive，IND（e⁺）］，将HBV DNA>10⁴ IU/mL且ALT水平正常的HBeAg阴性感染者定义为高HBV DNA水平HBeAg阴性不确定期［indeterminant HBV DNA high HBeAg negative，IND（e^-）DNA‐H］。血清HBV RNA水平在HBeAg阳性慢性HBV感染［7.3（6.2～7.6） log₁₀ U/mL］、HBeAg阳性CHB［7.1（6.3～7.7） log₁₀ U/mL］、HBeAg阴性CHB［3.6（3.0～4.7） log₁₀ U/mL］及HBeAg阴性慢性HBV感染者［1.3（0.2～1.9） log₁₀ U/mL］中依次下降；IND（e⁺）感染者的血清HBV RNA水平［3.1（2.0～3.7） log₁₀ U/mL］低于HBeAg阳性慢性HBV感染者和HBeAg阳性CHB患者；IND（e^-）DNA‐H感染者的HBV RNA水平［2.9（2.3～3.4） log₁₀ U/mL］介于HBeAg阴性慢性HBV感染者与HBeAg阴性CHB患者之间。本研究亦得出一致的结论，各分期所对应的血清HBV RNA水平分别为7.5（7.4～7.9） log₁₀ copies/mL、7.4（6.4～7.9） log₁₀ copies/mL、4.5（3.0～5.7） log₁₀ copies/mL和1.0（1.0～2.0） log₁₀ copies/mL，且HBeAg阳性慢性HBV感染不确定期感染者的血清HBV RNA水平［3.9（3.7～5.7） log₁₀ copies/mL］低于HBeAg阳性慢性HBV感染者和HBeAg阳性CHB患者；HBeAg阴性慢性HBV感染不确定期感染者的HBV RNA水平［2.0（1.0～3.0） log₁₀ copies/mL］介于HBeAg阴性慢性HBV感染者与HBeAg阴性CHB患者之间。血清HBV RNA联合其他病毒学标志物对慢性HBV感染自然史的研究具有一定价值，但其是否能作为自然史分期的指标仍需进一步探讨。 

本研究发现，在所纳入HBV感染者中，血清HBV RNA与HBV DNA呈强相关性（r=0.92，P<0.001），与HBsAg呈中度相关（r=0.67，P<0.001）；在HBeAg阳性或阴性者中HBV RNA与HBV DNA呈中度或强相关（HBeAg阳性：r=0.68，P<0.001；HBeAg阴性：r=0.84，P<0.001）；在HBeAg阳性者中，血清HBV RNA与HBsAg呈中度相关（r=0.61，P<0.001），而HBeAg阴性者的HBV RNA与HBsAg相关性较弱（r=0.31，P<0.001）。血清中的HBsAg可来源于cccDNA或整合的HBV DNA。HBeAg阳性者的HBsAg主要来源于cccDNA，而HBeAg阴性感染者的HBsAg主要来源于整合的HBV DNA。一项针对366例未经治疗的HBeAg阳性感染者的研究发现，血清HBV RNA水平与HBV DNA密切相关（r=0.72，P<0.001），与HBsAg呈中度相关（r=0.54，P<0.001）；在122例HBeAg阴性者中，血清HBV RNA水平与HBV DNA也密切相关（r=0.78，P<0.001），但与HBsAg的相关性较弱（r=0.19，P=0.04）。近期一项研究对122例未经治疗的CHB患者进行了血清HBV RNA检测，并比较了肝组织学HBV复制指标与血清HBV RNA水平的相关性，结果显示，HBeAg阳性患者的血清HBV RNA水平与肝内及血清病毒标志物（前基因组RNA、cccDNA、HBV DNA及HBsAg）均呈正相关；而在HBeAg阴性患者中，血清HBV RNA与肝组织前基因组RNA（r=0.77，P<0.001）、cccDNA转录活性（r=0.78，P<0.000 1）及血清HBV DNA（r=0.81，P<0.000 1）相关性较强，但与HBsAg水平无显著相关性。外周血HBsAg可来源于宿主基因组中整合的病毒序列，这一来源削弱了其在预测cccDNA水平和转录活性方面的临床价值。 

本研究根据相关文献，将血清ALT水平的正常值上限定为40 U/L。ALT水平高于正常值上限或肝活检表现为显著炎症是慢性HBV感染者进行抗病毒治疗的重要指征。然而，既往研究显示，ALT水平正常的HBV感染者存在中度肝纤维化（占比23.2%），存在显著肝脏炎症（占比20.8%）。因此，即使ALT处于正常水平，慢性HBV感染者仍可能存在肝损伤。2002年，有学者提出更新后的ALT上限（男性为30 U/L，女性为19 U/L）在识别肝脏炎症方面具有更高的敏感性，更易于发现轻度脏组织学病变的患者。2006年，美国肝病专家建议将ALT水平正常值上限调整为30 U/L（男性）和19 U/L（女性）。本研究根据ALT水平，对HBeAg阳性慢性HBV感染者（ALT<40 U/L）进一步划分，结果显示，ALT>30 U/L的男性及ALT>19 U/L的女性感染者的血清HBV RNA水平显著低于ALT≤30 U/L的男性及ALT≤19 U/L的女性感染者。此外，ALT水平处于正常高值的HBeAg阳性慢性HBV感染者的血清HBV RNA水平与HBeAg阳性CHB患者相似，提示二者的自然史更为接近。这一结果与目前CHB相关指南或共识中建议对该类患者进行抗病毒治疗的推荐意见一致。 

综上所述，本研究依据2022年版指南，对慢性HBV感染自然史不同阶段未经抗病毒治疗感染者的血清HBV RNA水平进行分析，结果显示，HBV RNA水平在未经抗病毒治疗的慢性HBV感染自然史不同阶段存在显著差异。血清HBV RNA与HBV DNA呈强相关性，而与HBeAg阳性或阴性者的HBsAg水平分别呈中度或弱相关性。在HBeAg阳性慢性HBV感染（免疫耐受期）中，ALT>30 U/L的男性及ALT>19 U/L的女性感染者的血清HBV RNA水平处于免疫耐受期和免疫清除期的过渡阶段，这一发现在临床实践具有重要指导意义，应予以充分重视。 

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https://www.lcgdbzz.org/cn/article/doi/10.12449/JCp50407