减少自相残杀！CAR-T细胞疗法新进展，最新Nature Cancer！

嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）疗法在血液系统恶性肿瘤（如B细胞白血病和淋巴瘤）中展现出显著的临床疗效，但其在实体瘤治疗中的效果仍然有限。实体瘤对CAR T细胞的抵抗机制复杂，可能涉及肿瘤微环境的免疫抑制、抗原异质性、T细胞浸润不足以及T细胞耗竭等因素。近年来，研究发现细胞间通讯的重要媒介——小细胞外囊泡（sEVs，如外泌体）可能在肿瘤免疫逃逸中发挥关键作用。sEVs能够携带肿瘤相关抗原、免疫调节分子等生物活性物质，并通过水平转移影响受体细胞的功能。然而，sEVs是否参与CAR T细胞治疗的抵抗机制尚不清楚。

宾夕法尼亚大学郭巍教授课题组发现，实体瘤在CAR T细胞攻击下会显著上调sEVs的分泌，这些sEVs携带肿瘤抗原（如MSLN、TRP1等），并将其转移至CAR T细胞表面，导致CAR T细胞相互识别并杀伤（即“自相残杀”，fratricide）。进一步研究表明，这一过程依赖于CAR T细胞分泌的TNF-α激活肿瘤细胞中的Rab27a信号通路，从而促进sEVs的释放。相比之下，血液肿瘤（如白血病）来源的sEVs因含有颗粒酶B抑制剂Serpin B9，可保护CAR T细胞免受自相残杀。基于这一发现，研究团队通过基因工程改造，构建了共表达Serpin B9的装甲型CAR T细胞（Se9-CAR T），显著提高了其在实体瘤中的存活率和抗肿瘤活性。此外，联合抗PD-1抗体可进一步增强疗效，为克服实体瘤对CAR T细胞的抵抗提供了新的策略。

该研究成果以“Overcoming extracellular vesicle-mediated fratricide improves CAR T cell treatment against solid tumors”为题，于2025年4月15日发表在《Nature Cancer》期刊上。钟文群为本论文的第一作者，郭巍为本论文的通讯作者。

【主要内容】

图1：CAR T细胞刺激下PDAC 4662肿瘤通过sEVs增加肿瘤抗原的分泌

通过建立PDAC 4662小鼠肿瘤模型并使用靶向MSLN的CAR T细胞治疗，研究发现CAR T细胞治疗后，肿瘤组织和血浆中分泌的sEVs（30-150 nm）显著增加。密度梯度离心和Western blot证实这些sEVs携带MSLN抗原，并与外泌体标志物（CD63、TSG101、CD9）共定位，而内质网标志物calnexin未检测到。ZetaView分析显示CAR T治疗组MSLN阳性sEVs比例显著升高，表明肿瘤通过sEVs主动释放抗原以响应CAR T细胞攻击。

图2：体外实验中CAR T细胞来源的TNF促进肿瘤细胞sEVs分泌和Rab27a激活

RNA-seq和GO分析发现，CAR T细胞条件培养基（CM）处理显著激活肿瘤细胞中TNF相关通路。体外实验证实，CAR T细胞分泌的TNF通过JFC1 pulldown实验激活Rab27a的GTP结合形式（2.5倍增加），且中和TNF抗体可阻断该效应。Tnfa-KO CAR T细胞的CM则无此作用，NTA显示sEVs分泌量减少60%，表明TNF-Rab27a轴调控sEVs分泌。

图3：体内实验中CAR T细胞来源的TNF促进肿瘤细胞Rab27a激活和sEVs分泌

在体实验进一步验证：携带tdTomato（4662瘤）或EGFP（B16-F10瘤）的小鼠中，野生型CAR T细胞治疗使肿瘤组织GTP-Rab27a水平升高3倍，而Tnfa-KO CAR T细胞无此效应。血浆sEVs的Western blot和ZetaView显示，MSLN/TRP1阳性sEVs仅在野生型CAR T组增加，Rab27a-KO肿瘤中该现象消失，证实TNF通过激活Rab27a驱动sEVs的体内分泌。

图4：肿瘤来源的sEVs介导肿瘤抗原向CAR T细胞的转移

共培养实验证明，人源MSLN-CAR T细胞摄取EM-MSLN细胞来源sEVs后，MSLN阳性率从0%升至8.69%。类似现象见于小鼠模型：Rab27a-KO肿瘤中CAR T细胞的MSLN转移减少70%，而外源注射野生型sEVs可恢复转移。抗原转移具有CAR特异性（MSLN-CAR T对4662 sEVs响应更强），提示sEVs通过抗原-CAR识别介导靶向递送。

图5：sEVs介导的肿瘤抗原转移导致CAR T细胞自相残杀

功能实验显示，4662 sEVs处理6小时即可诱导MSLN-CAR T细胞凋亡（存活率下降50%），抗MSLN抗体可阻断此效应。eFluor 450标记实验证实，sEVs预处理的CAR T细胞被新鲜CAR T杀伤增加3倍。在Rab27a-KO肿瘤中，CAR T细胞存活率提高2.5倍，而回输野生型sEVs逆转保护作用，证明sEVs介导的抗原转移直接引发自相残杀。

图6：装配Serpin B9的CAR T细胞抑制自相残杀并增强抗肿瘤效果

通过T2A序列构建共表达EGFP-Serpin B9的MSLN-CAR T细胞（Se9-CAR T）。Western blot验证Serpin B9成功表达（2.8倍增加），且不影响scFv表达。与普通CAR T相比，Se9-CAR T在sEVs存在下存活率提高80%，对4662细胞的杀伤效率增加40%。小鼠模型中，Se9-CAR T使肿瘤体积缩小60%，肿瘤浸润CAR T细胞数量增加5倍，且无体重下降。

图7：Se9-CAR T细胞联合PD1阻断改善实体瘤治疗效果

在PD-1抗体联合治疗中，Se9-CAR T组表现出协同效应：相比单用CAR T，联合组肿瘤完全消退率提高80%，小鼠生存期延长2倍。流式分析显示，联合组肿瘤内CAR T细胞中Granzyme B+和Ki67+比例分别增加3倍和4倍，表明Serpin B9装甲与免疫检查点阻断共同增强CAR T细胞的增殖与细胞毒性。

【全文总结】

本研究揭示了实体瘤抵抗CAR T细胞治疗的新机制：肿瘤细胞在CAR T细胞攻击下，通过TNF-α/Rab27a信号轴显著增加携带肿瘤抗原的sEVs分泌，这些sEVs将抗原递送至CAR T细胞表面，导致CAR T细胞相互识别并杀伤（自相残杀）。与血液肿瘤不同，实体瘤来源的sEVs缺乏颗粒酶B抑制剂Serpin B9，因而无法保护CAR T细胞。基于此，研究团队成功构建了共表达Serpin B9的装甲型CAR T细胞（Se9-CAR T），显著减少了自相残杀，并增强了其在实体瘤中的存活、浸润和杀伤能力。进一步研究发现，Se9-CAR T细胞联合PD-1阻断可产生协同抗肿瘤效应，显著延长小鼠生存期。该研究不仅阐明了sEVs介导的CAR T细胞功能障碍机制，更为优化实体瘤的CAR T治疗提供了创新性策略，即通过靶向sEVs的抗原转移和增强CAR T细胞自身保护的双重途径，克服实体瘤微环境的免疫抑制。这一成果为临床转化奠定了重要理论基础。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s43018-025-00949-8