单管qPCR挑战0.01% VAF水平的低频变异快速检测：阅尔基因发表新一代超高灵敏度变异检测技术——As-BDA

基因的低频变异检测是指从大量野生型DNA背景下检测少量具有生物学意义的突变序列，在肿瘤、遗传、感染等领域都有重要应用价值，其中突变序列的占比称为变异等位基因频率（VAF）。现有检测技术在便捷性、检测通量和检测下限（LoD）等方面各有所长，但基于qPCR的超低频变异检测方法仍鲜有报道。阅尔基因独有的抑制探针置换扩增（BDA）技术目前已经在Sanger、NGS、三代测序等下游技术平台实现不同场景下LoD的突破。2022年1月，阅尔基因的科学家在分析化学顶刊Analytical Chemistry上发表研究成果，整合BDA和探针法qPCR（AS-TaqMan）开发出新一代超高灵敏度变异检测技术——As-BDA，通过单管单次反应的多重qPCR即可完成低至0.01% VAF变异的检出。

DNA中存在的体细胞突变是癌症诊断、预后及用药指导的理想标志物。液体活检通过检测肿瘤细胞释放到体液中的微量ctDNA，能够与传统组织活检形成良好互补，并且在组织不可及或者连续监测耐药和复发风险的场景下发挥关键作用。由于临床待检样本中ctDNA的含量极低，对低频变异检测技术的灵敏度和特异性是不小的考验。比如实体瘤MRD检测技术的LoD要求在0.02% VAF左右。从结直肠癌患者的血浆样本中检测到0.4% VAF的KRAS突变即与西妥昔单抗耐药有关。另一方面，良好的特异性也能最大程度避免过度/无效治疗。当前，基于PCR的方法具有成本和便捷性的优势，但灵敏度普遍有限；液滴数字PCR（ddPCR）和基于高通量测序的技术（qBDA、Safe-SeqS、AmpliSeq等）可以实现低于0.1% VAF的LoD，但成本较高，操作流程也相对复杂。

表1. 常见低频变异检测方法对比

BDA是阅尔基因基于杂交热动力学原理开发的核酸变异富集技术，可以在PCR循环过程中有效抑制野生型序列的扩增，极大提高目标突变的信噪比。值得注意的是，BDA技术并非选择性扩增单一基因型位点，Blocker序列3‘端的富集区域内发生的所有变异均会得到正常扩增，这使得可检测范围大大提高，但同时也会限制整体的LoD：假如DNA聚合酶的错误率大于待检样本的VAF，在初始循环过程中可能会引入新的突变，非测序方法很难区分信号来源是真实突变还是PCR错误引入的。因此，通过BDA技术放大后再进行qPCR检测所能达到的LoD在0.1%左右，还要结合Sanger测序进一步确认。如果令TaqMan探针覆盖目标位点，同时整合到BDA反应过程中，理论上可使得BDA技术只检测特定基因型，并且流程更加简化。基于以上研究背景，As-BDA技术应运而生。

主要结果

As-BDA技术的上下游引物以及Blocker设计原则与BDA方法类似，不同的是额外引入了位点特异性的Taqman探针从而允许在BDA扩增循环内读取荧光信号，同时也进一步提高特异性。由此产生了As-BDA的设计模式：Blocker的5’端和3‘端分别与上游引物的3’端和探针的5‘端重叠，并且Blocker和探针的序列均覆盖了待测位点，三者通过结合自由能（binding energy）的差异设计放大目标突变数量的同时最大程度抑制住背景信号。

图1. 检测IDH2 418C>T突变的As-BDA序列设计举例

为了测试As-BDA的灵敏度和特异性，研究人员使用15ng含不同浓度SNV和小INDELs的样本进行检测，体系中最低仅有约4个拷贝左右的突变分子。从扩增曲线结果可以看出，野生型（WT）和0.1% VAF（T>A）的样本可以完全区分开，而不加Blocker时LoD只能达到10% VAF（图2b,e）。同等数量的变异分子，如果把input量提高到160ng，区分WT和低频变异样本将变得更具挑战。结果显示，尽管WT也产生了扩增信号，依然可以与0.01% VAF的样本稳定区分开来（图2c）。同等检测性能下，这是首次将qPCR的LoD带到万分之一水平。此外，T>C的转换突变与WT一样不会产生阳性结果，证明As-BDA具有高度的位点特异性（图2d）。进一步测试发现，将Blocker和探针分别设计在DNA的不同链上，抑或使用超声打断后的样本都能达到类似的检测性能。

图2. 单重As-BDA的灵敏度和特异性

随后，研究团队设计了多重As-BDA方法用于检测急性髓性白血病（AML）中最常见的IDH2突变（包括4种R140和6种R172），12种突变型连同内参一共分为三管，每管占用4个荧光通道。对于所有突变，使用15ng的gDNA模拟标准品依然可以稳定检出0.1% VAF的阳性样本，并且同一管中仅有对应探针产生的信号，并未出现其他荧光通道的干扰现象，WT的扩增曲线也几乎没有起峰，足见多重As-BDA在这个灵敏度下依然可以做到100%的特异性（图3）。

图3. 多重As-BDA的检测性能测试

那么As-BDA在真实样本中的表现如何？首先，研究团队使用人工合成样本绘制了各个突变位点的qPCR标准曲线用于绝对定量，随后检测两个不同VAF的商业化标准品，比较测量值和实际值的结果发现，两者之间的误差介于3.8~30%之间（图4）。进一步，利用11个AML临床样本、7个健康对照以及若干标准品对照，研究人员比较了As-BDA和ddPCR在实际样本中的定量表现。数据显示，两者的结果高度一致（图5）。另外，对一个阴性AML样本和健康对照分别进行9次重复实验发现，As-BDA结果全部为阴性，而ddPCR在0.1% VAF水平出现了数次假阳性结果。最后，研究人员还在肾癌患者FFPE和cfDNA样本中进行了测试，成功检出DNMT3A R882H突变且得出的VAF与使用NGS方法测得的相一致。

图4. 使用商业化标准品测试多重As-BDA的检测精度

图5. 使用临床样本比较多重As-BDA和ddPCR的检测一致性

总之，As-BDA技术将稀有突变富集和荧光定量PCR融为一体，通过单次反应实现超低频变异（SNV和INDELs）的多重检测。这种结合给分子诊断和基因组学研究带来至少两方面的实际优势：同时定性和定量地检测突变，并实现更快速的流程时间，从而可以在2小时内完成实验并给出结果，这是其他超低频变异检测技术，如ddPCR、NGS以及其他BDA方法难以实现的。研究人员通过人工合成DNA、商业标准品以及临床样本进行了大量实验，证明As-BDA能对15ng input中低至4个拷贝的变异分子进行准确定量，中位误差仅为9.1%，在更大样本量下LoD可进一步提升至0.01% VAF。15ng的起始量要求可以适用于液体活检在内的大多数临床检测场景。尽管As-BDA的定量能力与ddPCR旗鼓相当，但前者对设备的要求更低，多重设计更加灵活，对input最大投入量也没有严格限制。

传统的BDA-qPCR可以检测更多位点以及未知突变；As-BDA则针对确定位点实现更低的LoD以及周转时间（TAT），能快速精准地判断用药位点状态以及肿瘤基因组的动态变化，在基于液体活检的辅助诊断或监测方案上有很大应用前景。因为qPCR仪器中可用荧光通道的最大数量仅为六个，当前版本的As-BDA可设计重数相对有限，理论上可以通过荧光色谱排列组合策略进行改善。未来，可提高TaqMan探针法检测重数的方法有望进一步增强As-BDA的实用性，推动实体瘤MRD检测等应用领域的发展。

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